Increasing the brightness of red fluorescent proteins by saturation mutagenesis

Résumé

Les protéines rouges fluorescentes (PRF) sont des fluorophores génétiquement codés qui sont largement utilisés pour l’imagerie in vivo. On désire obtenir des variantes plus lumineuses pour toutes les applications des PFR. Auparavant, nous avons amélioré la brillance de mRojoA, un mutant décalé vers le rouge de la PFR populaire mCherry, par la conception d’un motif à trois étages d’anneaux aromatiques autour du chromophore. Le résultat fut une variante plus brillante, mRojo-VHSV, qui contient un motif à trois étages composé de chaînes latérales His et Tyr qui se plaquent contre le chromophore. Cet empaquetage du chromophore amélioré a abouti à une augmentation de luminosité d’environ 3 fois, au pH physiologique. Cependant, la chaîne de His dans le motif à trois étages de mRojo-VHSV a adopté un arrangement perpendiculaire aux deux autres, ce qui peut entraîner un arrangement d’empaquetage sous-optimal. Pour améliorer davantage l’empaquetage du chromophore de mRojo-VHSV, nous avons effectué la mutagenèse de saturation des résidus entourant son motif à trois étages (positions 62, 97, 165 et 199). Afin de cribler pour une luminosité améliorée, nous avons utilisé un essai de fluorescence avec microplaques. Au total, 376 colonies ont été criblées pour une luminosité améliorée. Le mutant le plus brillant, soit L199M, a été exprimé, purifié et caractérisé afin de déterminer ses propriétés spectrales détaillées. Nous avons constaté que le rendement quantique de cette variante est deux fois plus supérieur qu’initialement, résultant en une augmentation de la luminosité de deux fois par rapport à mRojo-VHSV, ainsi que d’une augmentation de la luminosité de 5,3 fois par rapport à mRojoA. La variante L199M améliorée sert comme base pour la poursuite de la recherche qui vise à améliorer davantage les propriétés spectrales de cette famille de PRF.